Le tableau qui fut peint en premier est dénommé Le martyre de saint Matthieu.
La scène se déroule dans une église, au moment où le saint s’apprête à baptiser plusieurs jeunes, un homme armé fait irruption dans l’église pour transpercer le prêtre pendant la messe. C’est une exécution brutale, représentée comme un fait divers : Le Caravage vous traîne devant l’épisode « en direct », au paroxysme de son intensité dramatique. Saint Matthieu à terre tente en vain de se défendre, tandis que le cri d’un enfant de chœur épouvanté qui s’enfuit fait écho à celui du tueur. Le Caravage participe à l’événement en se représentant à la gauche de l’assassin dans le personnage avec le bouc qui assiste à l’exécution du saint. Cet expédient confère un réalisme brûlant à la scène qui est racontée, qui semble se dérouler dans le présent et non pas dans un passé lointain.